國家生物醫學實驗細胞資源庫建立共享穩定表達cas9的肝癌、膽管癌細胞系

Establishment of Cas9 stably expressed human hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma cell lines

建立Cas9蛋白穩定表達的人肝膽癌細胞株,并驗證Cas9的基因編輯活性,以便利用CRISPR/Cas9系統開展肝膽細胞基因編輯的研究.方法 在人肝癌細胞(Huh7、PLC/PRF/5、HepG2、Hep3b、SK-HEP-1和Li-7)、人膽管癌細胞(RBE)和人膽囊癌細胞(GBC-SD)中,分別感染Cas9表達質粒pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo、pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro和Cas9m1.1,挑選單細胞克隆培養擴增.提取基因組DNA和總蛋白后,通過基因組聚合酶鏈反應(PCR)和Western blot驗證Cas9的穩定表達.選取其中3個細胞株并感染Lv-EF1α-mCherry,流式細胞術分選出mCherry陽性的細胞,再通過慢病毒感染靶向mCherry基因的向導RNA,細胞擴增后,通過基因組PCR、熒光顯微鏡下觀察和流式細胞術檢測mCherry被敲除的情況.結果 篩選到100個Cas9穩定表達的人肝膽癌細胞株,其中表達Cas9-Neo的細胞35株,表達Cas9-Puro的細胞25株,表達突變型Cas9的細胞40株.建立了3株mCherry穩定表達的細胞系Huh7-mCas9-M、PLC/PRF/5-Cas9-M和SK-HEP-1-Cas9-M.基因組PCR和測序顯示,同時感染2種gRNA的細胞基因組內存在mCherry片段缺失.熒光顯微鏡下,同時感染2種gRNA的細胞可以觀察到mCherry-EGFP+細胞.流式細胞儀檢測結果顯示,mCherry-EGFP+細胞占0.3％～93.6％. 成功建立了100個Cas9穩定表達的人肝膽癌細胞株,其中的Cas9蛋白具有基因編輯活性多種肝癌、膽管癌細胞系，經過我們轉染、篩選、鑒定，得到了穩定表達cas9且有活性的衍生細胞系，攜帶熒光標記。后續可方便用于細胞相互作用、信號通路上下游分子相互調節、基因功能研究。

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